大麻二酚（cannabidiol，CBD）可用于治療多種病癥及緩解疼痛。最近，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一種高純度CBD制劑（Epidiolex）用于治療癲癇。從大麻植物中提取的CBD粗提物含有大量其它物質(zhì)，包括精神活性物質(zhì)四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol，THC），由于THC在大多數(shù)國家是受管控的，因此純化CBD時(shí)必須要求將THC降低至100-1000 ppm。傳統(tǒng)的CBD純化方法，即單柱層析，是以犧牲CBD收率為代價(jià)將THC含量降低至該水平的，浪費(fèi)了大量目標(biāo)產(chǎn)物。通過Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification（MCSGP，多柱逆流溶劑梯度純化）可有效解決該問題，能夠分離出高純度、高收率、高產(chǎn)量的目標(biāo)產(chǎn)物，且純化效率顯著優(yōu)于單柱層析。本文闡述如何從預(yù)處理的大麻植物提取物中獲得高純度CBD，并將THC含量降低至要求范圍內(nèi)。
介 紹
在大麻二酚（CBD）的生產(chǎn)中，THC及其它植物性雜質(zhì)（如蠟質(zhì)和色素）很難去除，需要經(jīng)過一系列的預(yù)處理和純化步驟，才能從大麻中提取獲得高純度、低THC含量的CBD產(chǎn)品。
從大麻提取物中純化CBD需要進(jìn)行預(yù)處理，包括植物的粉碎、干燥、CO2提取、脫羧和蒸餾、層析和結(jié)晶。為了將大麻相關(guān)雜質(zhì)（主要是THC）降低至100 ppm，必須采用層析方法。提取物中的蠟質(zhì)和其它雜質(zhì)會(huì)對(duì)層析填料造成污染，所以必須在層析之前通過預(yù)處理將這些雜質(zhì)去除干凈。大麻素類物質(zhì)的水溶性較差，需要采用反相層析進(jìn)行純化，相關(guān)工藝的有機(jī)溶劑用量很大。一些雜質(zhì)與CBD產(chǎn)品出峰有重疊部分，分離具有挑戰(zhàn)性。采用單柱層析，需要在純度和收率之間做出權(quán)衡，兩者此消彼長，若要獲得高純度的CBD，通常收率都很低。如何在獲得高純度的產(chǎn)品的同時(shí)，保證高收率，是該工藝所面臨的難點(diǎn)。
MCSGP原理
Multi-column Counter-current Solvent Gradient Purification（MCSGP）是采用雙柱進(jìn)行連續(xù)純化，可以解決單柱層析時(shí)純度和收率無法同時(shí)保證的問題。
采用MCSGP，可將含有不純組分的產(chǎn)品回收再純化， 進(jìn)行循環(huán)式的層析操作，從而最大限度地提純產(chǎn)品， 使得純度和收率二者兼得。
圖1. 傳統(tǒng)單柱層析（左）：重疊組分被舍棄；MCSGP（右）：重疊組分被在線回收，再次純化。
材料和方法
工藝步驟：大麻是在室內(nèi)受控環(huán)境下生長的，需對(duì)大麻進(jìn)行采摘、干燥、預(yù)處理和純化。
圖2. CBD工藝步驟
層析樣品：
層析的上樣樣品是蒸餾液和甲醇的混合物，CBD純度為85.2%，濃度為250 g/L。該結(jié)果通過Agilent 1100型高效液相，采用C8反相柱測(cè)得，測(cè)定波長為230 nm，標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)樣量為10 μL。經(jīng)測(cè)定，上樣樣品中的THC含量為4.8%（48,000 ppm）。
圖3. 上樣樣品分析圖譜
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層析純化：
同時(shí)采用單柱層析和雙柱MCSGP純化CBD，測(cè)定280 nm處紫外吸收值。層析柱內(nèi)徑10 mm，柱床高度150 mm，柱床體積11.9 mL，裝填介質(zhì)為C18反相填料。每次上樣體積為0.37 mL。以70% B進(jìn)行等度洗脫，洗脫流速305 cm/h（即4 mL/min），洗脫時(shí)長90 min。洗脫完畢后進(jìn)行層析柱清洗。所有操作均在室溫（25℃±3℃）進(jìn)行。該條件下，層析柱的反壓為50 bar。
單柱層析結(jié)果
層析過程圖譜見圖4和圖5。分段收集洗脫產(chǎn)物，并進(jìn)行液相分析（圖5）。
圖4. C18純化CBD過程圖譜，顯示UV280 nm、CBD濃度、THC含量（THC含量在10min左右開始顯著升高）
圖5. 層析過程圖譜局部放大，顯示目標(biāo)物（CBD）和主要雜質(zhì)濃度
MCSGP設(shè)計(jì)
MCSGP采用與單柱工藝相同的層析柱、溶劑及基本工藝參數(shù)。
圖6. MCSGP工藝設(shè)計(jì)流程圖
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STEP 1：根據(jù)分段收集及液相分析結(jié)果，對(duì)單柱層析圖譜進(jìn)行區(qū)域劃分設(shè)計(jì)（圖7）。
圖7. 單柱層析圖譜進(jìn)行區(qū)域劃分設(shè)計(jì)
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A：CBD濃度2.7 g/L（2,000 mAU）時(shí)開始進(jìn)行回收（recycle）；
B：CBD濃度13.3 g/L（10,000 mAU）時(shí)開始收集目標(biāo)產(chǎn)物（product）；
? ? ? ?C：紫外值降低至最大峰值90%時(shí)結(jié)束收集目標(biāo)產(chǎn)物，并再次開始回收；
D：6 min后，結(jié)束回收。
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STEP 2：設(shè)定層析柱規(guī)格及上樣量。MCSGP所用2根層析柱的規(guī)格與單柱層析完全相同。
STEP 3：設(shè)定基本工藝參數(shù)。MCSGP基本工藝參數(shù)與單柱層析完全相同。
STEP 4：設(shè)定cycle次數(shù)，MCSGP向?qū)к浖詣?dòng)顯示上樣總量，自動(dòng)生成StartUP及ShutDown方法。如因環(huán)境條件（溫度等）造成出峰漂移等，可選擇開啟MControl過程控制功能，保證工藝穩(wěn)定性。
MCSGP向?qū)к浖勺詣?dòng)計(jì)算回收階段的在線稀參數(shù)，并可顯示所需進(jìn)料的總體積、溶劑和運(yùn)行時(shí)間等。
MCSGP操作
為了優(yōu)化MCSGP工藝，在不同的操作條件下進(jìn)行了多次運(yùn)行，對(duì)產(chǎn)品洗脫區(qū)和回收區(qū)的劃分進(jìn)行了細(xì)微調(diào)整，最終確定出最佳條件，并以該條件運(yùn)行MCSGP。圖8顯示了最終用于CBD純化的MCSGP運(yùn)行圖譜，總計(jì)運(yùn)行了8個(gè)cycle，由圖可見cycle重現(xiàn)性良好。
圖8. MCSGP運(yùn)行圖譜，總計(jì)運(yùn)行8個(gè)cycle。該圖僅顯示柱1的UV變化，藍(lán)色
和綠色區(qū)域?yàn)榛厥諈^(qū)，位于藍(lán)色和綠色之間的紅色區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)產(chǎn)物收集區(qū)。
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圖9. MCSGP各cycle的疊加圖譜
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圖9各cycle重疊性良好，表明MCSGP功能運(yùn)行穩(wěn)定，各cycle的產(chǎn)率、產(chǎn)品濃度及純度均保持穩(wěn)定。保留時(shí)間和峰形的變化由MControl自動(dòng)補(bǔ)償，MControl根據(jù)紫外線閾值啟動(dòng)CBD收集，當(dāng)紫外值降低至最大峰值90%時(shí)結(jié)束收集。
使用分析液相測(cè)定MCSGP每個(gè)cycle洗脫產(chǎn)物（2個(gè)/cycle，每柱各1個(gè)）的純度和產(chǎn)物濃度。圖10顯示，CBD產(chǎn)品的純度大于99.5%。
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圖10. MCSGP純化所得CBD液相分析圖譜
單柱層析與MCSGP的對(duì)比
從收率、純度、產(chǎn)率、產(chǎn)品濃度和溶劑消耗等方面對(duì)單柱層析和雙柱MCSGP進(jìn)行了計(jì)算和比較，MCSGP在各方面均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)。
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圖11. 純度 - 收率曲線
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圖11為單柱層析與MCSGP收率對(duì)比圖。已規(guī)定最大THC含量為100 ppm，在這一水平，單柱層析的CBD收率僅為52%，而MCSGP的CBD收率為94%，比單柱層析高出80%。
圖12. 純度 - 產(chǎn)率曲線
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MCSGP可用于不同工藝要求。如果對(duì)目標(biāo)產(chǎn)品的純度要求并不高，采用MCSGP可使產(chǎn)率進(jìn)一步提高。比如某企業(yè)要求THC含量上限為1000 ppm時(shí)，收率水平不得低于85%，用MCSGP代替單柱層析后，產(chǎn)率由原來的8 g/L/h提高到了60 g/L/h以上。而另一工藝情況為，當(dāng)從單柱層析轉(zhuǎn)換為MCSGP時(shí)，保持產(chǎn)率不變，雜質(zhì)THC含量可從1000 ppm降低至100 ppm。見圖12純度 - 產(chǎn)率曲線。
圖13. 純度 - 溶劑消耗曲線
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圖13顯示了單柱層析和MCSGP的溶劑消耗對(duì)比。在要求THC最大含量為1000 ppm時(shí)，MCSGP可使溶劑消耗量降低30%。單柱層析的溶劑消耗量為每mL上樣樣品消耗95 mL溶劑，而MCSGP的溶劑消耗量僅為每mL上樣樣品消耗65 mL溶劑。
總結(jié)
與單柱層析相比，MCSGP在大麻二酚（CBD）的純化和雜質(zhì)THC的去除方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。主要包括：
1. 在THC含量要求100 ppm時(shí)，MCSGP可使CBD收率提高80%左右；
2. 在THC含量要求1000 ppm時(shí)，MCSGP可使產(chǎn)率提高7.5倍左右；
3. 在THC含量要求1000 ppm時(shí)，MCSGP可使溶劑消耗量降低30%。
溶劑消耗量的減少可顯著降低溶劑采購成本、溶劑再生/處理成本，并減少制備和儲(chǔ)存溶劑所需的占地面積。
MCSGP的每個(gè)cycle僅收集2次（per cycle / per switch），而單柱層析過程的各組分需要分段收集、送檢，因此采用MCSGP，可使HPLC檢驗(yàn)工作量顯著降低。
通過MCSGP提高產(chǎn)率，可應(yīng)用于多種生產(chǎn)方式：
1. 可采用更小規(guī)格的層析柱，在相同的時(shí)間內(nèi)，完成與單柱層析相同的生產(chǎn)任務(wù)；
2. 可采用與單柱層析相同規(guī)格的層析柱，在更短的時(shí)間內(nèi)完成生產(chǎn)任務(wù)；
3. 層析介質(zhì)體積相同時(shí)，可在相同時(shí)間內(nèi)獲得更多的產(chǎn)品。
層析系統(tǒng)介紹
Contichrom HPLC：Contichrom HPLC是一套多用途的制備型實(shí)驗(yàn)室級(jí)層析系統(tǒng)，可運(yùn)行多種單柱和雙柱模式。ChromIQ是Contichrom系統(tǒng)的操作軟件，其中包括MCSGP向?qū)Чδ堋?/p>
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EcoPrime Twin HPLC ：EcoPrime Twin HPLC為生產(chǎn)型連續(xù)流層析系統(tǒng)，可在GMP條件下運(yùn)行MCSGP功能，滿足MCSGP工藝的有效線性放大。
北京慧德易專注于層析領(lǐng)域十余年，現(xiàn)與瑞士ChromaCon公司強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，將世界領(lǐng)先的Contichrom雙柱連續(xù)流層析技術(shù)引進(jìn)中國，并已于2017年在北京昌平生命科學(xué)園蛋白質(zhì)藥物國家工程研究中心成立慧德易實(shí)驗(yàn)室&培訓(xùn)中心，現(xiàn)已成功舉辦多期連續(xù)流技術(shù)培訓(xùn)班。
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北京慧德易實(shí)驗(yàn)室&培訓(xùn)中心可為廣大客戶提供工藝開發(fā)、產(chǎn)品展示及培訓(xùn)服務(wù)，歡迎廣大客戶蒞臨指導(dǎo)！
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