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??? 隨著生物制藥以及診斷試劑領(lǐng)域?qū)慰寺】贵w ( mAbs ) 的需求日益旺盛，需要更大量、更高純度的抗體產(chǎn)品。因此，通過(guò)層析法實(shí)現(xiàn)抗體的下游純化變得日趨重要。

??? 各種模式中，蛋白A親和層析法可獲得高純度的單抗，因此普遍用于初始純化步驟（即初期捕獲）中。離子交換層析法 ( IEC ) 的高載量特點(diǎn)也使之在抗體的制備純化中被廣泛采用。疏水相互作用層析法 ( HIC ) 具有去除抗體多聚體以及脫落的蛋白 A 配體等雜質(zhì)的性能。混合模式層析法（MXC，含羥基磷灰石類分離介質(zhì)）也被運(yùn)用到了抗體的層析純化工藝之中。

采用蛋白A親和層析法的純化工藝

??? 采用蛋白A親和層析法的純化工藝是指第一步捕獲使用蛋白A親和層析，其后步驟使用其他層析模式去除諸如宿主細(xì)胞蛋白、核酸、抗體多聚體和脫落的蛋白A配體等雜質(zhì)的方法。工藝中如果選用陰離子交換層析法（包括陰離子交換膜層析法），則是通過(guò)目標(biāo)抗體流穿或吸附并去除雜質(zhì)而達(dá)到純化抗體的目的。


??? 圖 1.????? 采用了蛋白A親和層析法的純化工藝示例

不采用蛋白A親和層析法的純化工藝

??? 不采用蛋白A親和層析法的純化工藝可降低工藝成本。可通過(guò)結(jié)合使用陽(yáng)離子交換層析法 ( CEX ) 、陰離子交換 層析法 ( AEX ）、疏水相互作用層析法 ( HIC ) 以及混合模式層析法 ( MXC ) 實(shí)現(xiàn)對(duì)單抗的高純度純化制備。

??? 圖 2.????? 不采用蛋白A親和層析法的純化工藝示例

表1. 用于單抗純化的 Toyopearl 產(chǎn)品舉例

蛋白A親和層析填料（耐堿、高載量 / 高流速型）

??? 蛋白A填料在單抗純化工藝中具有載量高，處理速度 快等眾多優(yōu)勢(shì)，非常適合用于單抗純化的捕獲階段。

?????? TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 是東曹推出的新型的耐堿型、高載量蛋白 A 填料，即使是高滴度、高濃度（10 g/L）的單抗樣品，在常用流速下也具有非常高的動(dòng)態(tài)載量。

?????? TOYOPEARL AF-rProtein A-650F作為老一代的蛋白A產(chǎn)品，可以在高流速（柱留時(shí)間 1 min）下進(jìn)行樣品的處理。東曹的填料機(jī)械強(qiáng)度高，在柱高為 20-30 cm 的情況下，仍然可以使用高流速的條件進(jìn)行分離（線性流速500-1000 cm/h），同時(shí)保持較高的動(dòng)態(tài)載量，從而提高抗體純化工藝的生產(chǎn)效率。

?????? TOYOPEARL AF-rProtein A HC-650F 和 AF-rProtein A 650F 是將新的耐堿型蛋白A配體多位點(diǎn)結(jié)合到填料基體上，對(duì)鼠 IgG1、IgM 以及 Fab 具有很強(qiáng)的親和力。并且在 堿性條件下多次CIP 循環(huán)后，吸附載量也不會(huì)降低。

離子交換層析填料（高載量、強(qiáng)耐堿型）

??? 隨著官能團(tuán)鍵合技術(shù)的進(jìn)步，目前主流的離子交換填料對(duì)于抗體的吸附載量一般都能打到 100-170 g/L。抗體 的等電點(diǎn)一般為中性或者弱堿性，所以陽(yáng)離子交換填料在抗體的純化工藝中一般適用于吸附 - 洗脫模式。

???????TOYOPEARL GigaCap S-650M 對(duì)抗體的動(dòng)態(tài)載量 非常高，通過(guò)優(yōu)化洗脫液，在 1000 cm/h 的線性流速下，動(dòng)態(tài)載量約為90 g/L，并且可以得到與蛋白 A 填料相媲美的純度。

????陰離子交換填料在抗體的純化工藝中一般通過(guò)流穿模式來(lái)去除樣品中的宿主細(xì)胞蛋白、核酸、內(nèi)毒素、多聚體等雜質(zhì)。? TOYOPEARL GigaCap Q-650M、TOYOPEARL Q-600C AR、TOYOPEARL NH2 -750F 等，均是高載量型的優(yōu)異層析填料。

?????? TOYOPEARL 離子交換填料不僅對(duì)抗體有著較高的載量，在洗脫時(shí)，抗體的洗脫峰型尖銳、不拖尾的特點(diǎn)也減少了工藝中樣品的處理時(shí)間，提高生產(chǎn)效率。

??? 培養(yǎng)的上清液中如果含有鹽（0.1-0.15 mol/L），可以使 用 TOYOPEARL GgiaCap CM-650M、TOYOPEARL Q-600C AR、TOYOPEARL NH2-750F 具有鹽耐性的填料 進(jìn)行直接上樣分離。

混合模式層析填料（高載量型）

??? 此類填料的官能團(tuán)即具有離子性，又具有疏水性。混合模式填料對(duì)于含有一定鹽濃度（0.15 mol/L NaCl）的單抗樣品可以進(jìn)行直接上樣，進(jìn)行吸附和洗脫分離。

?????? TOYOPEARL MX-Trp-650M 的官能團(tuán)為色氨酸，對(duì)抗體具有非常高的動(dòng)態(tài)載量（70 g/L 以上）。相比于蛋白 L 填料，對(duì)抗體片段（Fab）和單體（scFv）都有著更高的動(dòng)態(tài)載量。

疏水層析填料（高載量型）

??? 疏水相互作用層析法不僅可以分離諸如宿主細(xì)胞蛋白、核酸、脫落的蛋白 A 配體等雜質(zhì)，還可以分離抗體的多聚體和異構(gòu)體。

被稱為第二代疏水層析填料的 TOYOPEARL 600 系列產(chǎn)品，通過(guò)優(yōu)化填料的孔徑從而大大提高了對(duì)單抗的吸附載量。抗體的動(dòng)態(tài)吸附載量一般為20-45 g/L，但是我們需要通過(guò)抗體的疏水性、回收率、分辨率等條件來(lái)選擇最優(yōu)的疏水填料。一般而言，苯基和丁基（TOYOPEARL Phenyl-650M、Phenyl-600M、Butyl-650M、Butyl-600M）適用于單抗的分離，但是對(duì)于疏水性比較強(qiáng)的抗體則需要選擇疏水性比較弱的 TOYOPEARL PPG-600M疏水填料。最新的研究中，有使用混合鹽溶液（Dual salts）來(lái)提高吸附載量的案例，TOYOPEARL Hexyl-650C 在流穿模式的運(yùn)用，TOYOPEARL Phenyl-650、Butyl-650、 PPG-600、Ether-650M 等也被運(yùn)用在 ADC 藥物的分離 純化中。

工藝開(kāi)發(fā)、篩選用預(yù)裝柱（ToyoScreen產(chǎn)品）

?????? ToyoScreen篩選用預(yù)裝柱（1 ml裝及5 ml裝）包括各種層析模式，可用于層析填料的篩選、精制純度和回收率的研究以及層析條件的優(yōu)化工作等方面。與HPLC或MPLC 系統(tǒng)連用可簡(jiǎn)單地對(duì)抗體的分離效果進(jìn)行評(píng)估。

高速分離、高分辨率、小粒徑填料 （離子交換填料、疏水填料）

??? 使用離子交換或疏水填料分離異構(gòu)體的時(shí)候，對(duì)分辨率要求特別高的情況下，可以使用粒徑為20-30 μm的小粒徑填料例如TSKgel PW系列，或者TOYOPEARL GigaCap Q-650S和GigaCap S-650S來(lái)進(jìn)行純化分離。

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????? ?圖3. 單克隆抗體多聚體的分離

? 圖4. 抗體純化的工藝平臺(tái)示例 ：AFC-CIEC-HIC